Piesardzības pasākumi poliakrilamīda gela elektroforēzes laikā

· poliakrilamīdsGelam jābūt akrilamīda monomēram, polimerizācijas izejvielai, katalizatoram un sāls un bufera maisījumam kopā.

· akrilamīdsun BIS (N, N'-metilēna dubultakrilamīds) ir monomēra formas gēla matrica.

· amonija persulfāts iedarbina līmes polimerizācijas procesu. Līmes pagatavošanai nepieciešams 10% amonija persulfāta šķīdums, kas pagatavots ūdenī. Lielākā daļa informācijas norādīja uz nepieciešamību pēc aktīvas lietošanas. Tomēr 10% šķīdumu var uzglabāt 4°C temperatūrā vairākas nedēļas bez ievērojama aktivitātes zuduma. Kad līme vairs nesalipst, atšķaidiet līdz 10 ml un izmetiet.

Padoms: Procentuālā daļaakrilamīdsSekvencēšanas līme un olbaltumvielu līme nav viens un tas pats. Ja izmantojat iepriekš pagatavotu akrilamīda:BIS šķīdumu, pārliecinieties, ka iegādājaties pareizo pudeli.

· TEMED (N, N, N', N'- tetrametiletilēndiamīns) ir katalizators, kas iepildīts brūnā pudelē un ievietots ledusskapī. Pievieno tieši pirms līmes ieliešanas.

· Poliakrilamīda elektroforēzē izmantotais stikls elektroforēzē jāmazgā pirms un pēc katras reizes. Pēc elektroforēzes nomazgājiet ar mīkstu birsti un drānu karstā ziepjūdenī, noskalojiet ar destilētu ūdeni un ļaujiet nožūt.

· mitrums un putekļi var izraisīt dobu polimēru bojājumus. Pirms elektroforēzes notīriet stikla plāksni ar stikla tīrīšanas līdzekli un noslaukiet to ar mīkstu birsti. Noskalojiet ar destilētu ūdeni un rūpīgi nosusiniet ar papīra salveti. Skalošana ar 70% etanolu pirms noslaukšanas ar papīru palīdz notīrīt un paātrināt žūšanu. Pievienojiet akrilamīda paraugus secīgi: BIS, ūdeni, buferšķīdumu, amonija persulfātu, TEMED. Labi sakratiet un nekavējoties ielejiet.

Pirms polimerizācijas nav nepieciešams degazēt poliakrilamīdu. (Akrilamīdu agrāk ievietoja vakuumā, lai izvadītu burbuļus, jo skābeklis kavē polimerizāciju.)

Horizontāli līmes punktu paraugu uzgaļi.

· Ievietojiet melna papīra lapu apakšējā lodziņā, melnu fonu izveidojot kādu parauga caurumu, lai varētu skaidrāk redzēt.
· līmes tvertnes pildīts buferis, tieši virs koloīda.
· Ja malai ir gaisma, ieslēdziet gaismu, ļaujiet gaismai spīdēt koloīdā veidā. Ievelciet paraugu pipetē.
· izmantojot automātisko pipetēšanas ierīci.
· 10–200 μM tilpumā lielākajā daļā parauga punktu var izmantot 1 šķidruma kustīgu punktu. Ļoti maziem parauga caurumiem (mazāk nekā 10 μ1) ērtāka ir garā pipetes galviņa, ko izmanto līmes sekvencēšanai.

· pipetējot, paraugs ir tikko iegremdēts, ieelpojot lēni kustīgu šķidrumu. Paraugs var šķist lipīgs ar glicerīnu, un strauja sūknēšana var iesūknēt gaisa burbuļus pipetes galviņā.

Pēc pipetēšanas galviņas ieelpošanas paraugi uzmanīgi pārvietos šķidruma galviņu pa caurules malu vai ar papīra salveti izsūks šķidruma galviņu ārpus pilieniņām. Esiet uzmanīgi, lai neiesūktu paraugu.

Ievietojiet paraugu parauga caurumā

· pipetēšanas ierīce, lai uzturētu nelielu spiedienu, liek paraugiem nedaudz pārvietot pārplūdes šķidruma galviņu.
· pipetēšanas galviņa, ievietota buferšķīdumā, nedaudz augstāk par punktveida caurumiem, uztur pozitīvu spiedienu. Pipetes galu var ievietot nelielā caurumā.
· lēnām un vienmērīgi izvadiet paraugus. Pipetes gals tiek novietots virs parauga atveres, un paraugs tajā iegrims. Ļaujiet paraugam iegrimt, lai aizpildītu parauga atveri, nevis spiesties uz iekšu.
· Kad pēdējais parauga piliens ar šķidruma galviņu pārvietosies uz otro kāju, lēnām paceliet šķidruma kustību, pārvietojieties ārā no bufera

Kā veikt vertikālu līmes paraugu ņemšanu?

· vertikāli līmes punktu parauga caurumi, kas izveidoti starp diviem stikla gabaliem. Ļoti plānā līmes kārtiņā pipetes galviņu pat nevar ievietot starp divām stikla plāksnēm. Uzmanieties no glicerīna! Novietojiet pipetes galviņu virs parauga cauruma, un paraugs tajā iegrims.
· Pirms parauga novietošanas pārliecinieties, ka vertikālais polipropilēna acilgela punkts ir novietots uz parauga atveres, un tā ir jānoskalo tīri. Noskalojiet nepolimerizēto akrilamīdu un ūdeni, kas var parādīties parauga atveres apakšā. Ūdens var ievērojami samazināt parauga atveri. Izmantojiet 25 ml vai 50 ml šļirci un 18. izmēra adatu. Ielejiet elektroforēzes buferšķīdumu un uzmanīgi izskalojiet parauga atveri.
· var būt grūti saskatīt parauga caurumu, bet tajā pašā laikā pārējais ir viegli. Ja ir lieki caurumi, parauga buferšķīdumu var pārbaudīt ar bromfenola zilo.