Piesardzības pasākumi poliakrilamīda gēla elektroforēzei

· poliakrilamīdsgēla misa ar akrilamīda monomēru, polimerizācijas izejmateriālu, katalizatoru un sāls un bufera maisījuma tiesībām kopā.

· akrilamīdsun BIS (N,N'-metilēn-dubultakrilamīds) ir monomēra formas gēla matrica.

· amonija persulfāts uzsākt līmes polimerizācijas procesu. Līmes pagatavošanai nepieciešams 10% amonija persulfāta šķīdums, kas pagatavots ūdenī. Lielākā daļa informācijas norādīja uz nepieciešamību pēc aktīvas lietošanas. Tomēr 10% šķīdumu var novietot 4 ℃ temperatūrā vairākas nedēļas, būtiski nezaudējot aktivitāti. Uzpildiet līdz 10 ml un izmetiet, kad līme nesaplūst.

Padoms: procentuālā daļa noakrilamīdssekvencē līme un proteīna līme nav viens un tas pats. Ja izmantojat iepriekš sagatavotu akrilamīdu: BIS šķīdumu, pārliecinieties, ka esat iegādājies pareizo pudeli.

· TEMED (N, N, N ', N '- tetrametiletilēndiamīns) ir katalizators, brūnā pudelē, ievietots ledusskapī. Pievienojiet tieši pirms līmes ieliešanas.

· poliakrilamīda elektroforēze elektroforēzē izmantotais stikls jāmazgā pirms un pēc katras reizes. Pēc elektroforēzes nomazgājiet ar mīkstu suku un drānu karstā ziepjūdenī, noskalojiet ar destilētu ūdeni un nostādiniet, lai nožūtu.

· mitrums un putekļi var izraisīt ar dobu polimēru. Pirms elektroforēzes notīriet stikla plāksni ar stikla tīrītāju un noslaukiet to ar mīkstu suku. Nomazgājiet ar destilētu ūdeni un rūpīgi nosusiniet ar papīra salveti. Skalošana ar 70% etanolu pirms noslaucīšanas ar papīru palīdz notīrīt un paātrināt žāvēšanu. Secīgi pievienojiet akrilamīda paraugus: BIS, ūdeni, buferšķīdumu, amonija persulfātu, TEMED. Labi sakratiet un nekavējoties ielejiet.

Pirms polimerizācijas nav nepieciešams degazēt poliakrilamīdu. (Akrilamīdu agrāk ievietoja vakuumā, lai noņemtu burbuļus, jo skābeklis kavē polimerizāciju.)

Horizontālo līmes punktu parauga uzgaļi.

· Apakšējā lodziņā ielieciet melna papīra gabalu melnā fona, lai izveidotu parauga caurumu, lai redzētu skaidrāk.
· ar līmes tvertni piepildīts buferis, tieši virs koloīda.
· ja malai ir gaisma, ieslēdziet apgaismojumu, ļaujiet gaismai spīdēt koloidāli. Ievelciet paraugu pipetē.
· izmantojot automātisko pipetēšanas ierīci.
· 10-200 mu 1 šķidruma kustības punktu var izmantot lielākajā daļā parauga punktu. Ļoti maziem parauga caurumiem (mazāk nekā 10 μ1) ir ērtāk izmantot garo pipetes galvu, ko izmanto līmes sekvencēšanai.

· pipetēšana, tikko iegremdēta paraugā, ieelpojot lēni kustīgu šķidrumu. Paraugs var izskatīties lipīgs ar glicerīnu, un ātra sūknēšana var ievilkt pipetes galviņā gaisa burbuļus.

· paraugi pēc pipetes galviņas ieelpošanas viegli pārvietos šķidruma galvu pa caurules malu vai slaucīšanas papīrs iesūks šķidruma galvu ārpus pilieniem. Esiet uzmanīgi, lai nesūktu paraugu.

Ievietojiet paraugu parauga caurumā

· pipetēšanas ierīce, lai saglabātu nelielu spiedienu, liktu paraugiem nedaudz pārvietot pārplūdes šķidruma galvu.
· pipetes galviņa, kas ievietota buferšķīdumā, nedaudz augstāka par vietas caurumiem, uztur pozitīvu spiedienu. Pipetes galu var ievietot nelielā caurumā.
· lēni un vienmērīgi izņemiet paraugus. Pipetes galu novieto virs punktveida parauga cauruma, un paraugs iegrims caurumā. Ļaujiet paraugam nogrimt, lai tas aizpildītu parauga caurumu, nevis stumtu.
· pēc pēdējā parauga piliena ar šķidruma galvu šķidrums virzīsies uz otro kāju, lēnām pacels šķidruma kustību, iziet no bufera

Kā veikt vertikālo līmes paraugu ņemšanu?

· vertikālās līmes punkta parauga atveres, kas izveidotas starp diviem stikla gabaliem. Ļoti plānā līmē pipetes galvu pat nevar ievietot starp divām stikla plāksnēm. Skatieties glicerīnu! Uzlieciet pipetes galviņu virs parauga cauruma, un paraugs iegrims tajā.
· punkts paraugs pirms, noteikti likt vertikālo punktu polipropilēna acilgēla parauga caurums ir izskalots tīrs. Nomazgājiet nepolimerizēto akrilamīdu un ūdeni, kas var parādīties parauga cauruma apakšā. Ūdens var ievērojami samazināt parauga caurumu. Lietojiet 25 ml vai 50 ml šļirci un 18. izmēra adatu. Ielejiet elektroforēzes buferšķīdumu un uzmanīgi izskalojiet parauga caurumu.
· var būt grūti saskatīt parauga caurumu, bet tajā pašā laikā pārējais ir viegli. Ja ir pārāk daudz caurumu, parauga buferšķīdumu var pārbaudīt ar bromfenolzilo.